2014年05月21日

杨代常:种出“人血清白蛋白”不是科幻

  跟许多生物医药创新企业始创人不同,自诩农业出身的禾元生物创始人兼董事长杨代常在超40岁“高龄”才转攻生物制药方向。或许是这个缘故,他一出手便埋头一个37年前学界就已提出、但一直未见成熟产品的方向——不依赖血浆、安全、廉价的重组人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)。

  HSA具有多种临床应用价值,广泛用于肝硬化腹水、烧伤烫伤、手术后体液的补充,失血过多导致的休克、脑水肿、癌症和艾滋病人放化疗的辅助治疗等。此外,还广泛用于疫苗赋形剂、蛋白药物剂以及动物细胞和干细胞培养添加剂。

  用自己研究多年的水稻作为表达平台,顶着诸多质疑与劝阻,在投入研究的10年后,杨代常的梦想——在水稻上种出“人血清白蛋白”的现实径日渐清晰。继去年拿到全球首个植物源重组人血清白蛋白注射液临床批件后,武汉禾元生物以水稻胚乳细胞作为生物反应器生产的植物源重组人血清白蛋白(Recombinant Human Serum Albumin from Oryza sativa,OsrHSA)在10月正式启动Ⅰ期临床。

  “与基于细胞培养和发酵的表达体系相比,水稻种子作为表达平台还有一个非常大的优势——节能、环保、高效和低成本,依靠光合作用即可生产出大量的重组蛋白,扩大生产,只要种植就能解决问题了。”

  着手研究前,杨代常对国内HAS市场摸了个底:每年需求量估计在420 吨左右。可是血浆来源有限又了HAS的产能。以国内市场为例,中检院的批签发数据显示,去年进口人血白蛋白市场占比已超过5成。

  “除了血浆短缺原因,寻找血来源的重组人血清白蛋白,还可规避病毒传染风险,避免血源性疾病。”杨代常解释,1981年开始,研究者就尝试在细菌、酵母、动物细胞和植物等宿主中采用生物技术生产重组人血清白蛋白。然而,研究不尽人意,细菌、酵母、动物细胞不适于表达重组人血清白蛋白。

  转换思的杨代常把目光放到了植物。转基因植物很早就被用来开展农业新品种培育和重组蛋白表达研究,但表达水平一直是一大瓶颈,同时下游加工与贮藏也受到时空。据悉,人血清白蛋白基因由植物表达是马铃薯,然后利用叶绿体表达体系,但当重组蛋白表达水平高时,蛋白容易聚集形成类似于细菌“包涵体”的物质,这些不溶的蛋白往往失去了活性,如人血清白蛋白,最终效果不理想。

  比较而言,种子表达体系具有表达水平高、生产成本低以及加工便利和放大容易等显著优势,可以说是规模化生产中较成熟的表达体系。“更理想的是,种子作为植物天然的储存器,可以在常温下储藏4~5年不生物活性。”杨代常说,同时种子占用空间小,运输方便,可以很灵活地安排后续加工。

  不过,杨代常选择水稻胚乳细胞作为表达平台也不仅仅因为“条件合适”。作为我国著名遗传学家和水稻生物学家、杂交水稻研究朱英国院士的“朱门”大,杨代常踏上研究道的契机是1975年在一次杂交水稻培训班上与朱英国的首次接触。

  10年后,他在朱英国的帮助和鼓励下,以首届插班生的身份考入武汉大学,一成为朱英国的第一个硕士生、第一个博士生。毕业后,杨代常到美国、新加坡和菲律宾等学习、工作,成为美国一家生物技术公司的首席科学家和实验室主任。2005年,接到朱英国电话后,他毅然放弃美国的一切,回到母校武汉大学投入研究。

  不难看出,水稻,从杨代常起步之初就一直占据核心。“水稻胚乳细胞具有完整的真核细胞蛋白质加工体系,重组蛋白质的翻译、折叠和修饰都与哺乳细胞十分相近。”杨代常谈到最终决定用水稻种子作为表达平台时表示。

  “水稻是我国的主食,已有几千年的食用历史,其生物学背景清楚,目前没有任何有关动物病原菌和病毒侵入植物细胞和植物病毒与人共患的报道,因而利用水稻表达重组蛋白质,完全杜绝动物或人类病原菌或病毒的污染,具有更好的安全性。”

  作为静脉注射剂,安全性是OsrHSA最关键的条件。此次临床试验前,杨代常多次邀请临床专家一起,反复讨论植物源重组人血清白蛋白注射液Ⅰ期临床试验方案。

  杨代常告诉记者,选择水稻胚乳细胞作为生物反应器的另一个重要原因正是基于人体对大米蛋白质有较高耐受性的假设。比较而言,酵母、细菌细胞壁有复杂的糖结构,人对这类反应较。

  为了让人血清白蛋白更适合在水稻种子中合成,杨代常带领研究团队对人血清白蛋白基因进行和优化。他们攻关的水稻胚乳生物反应器技术就是利用基因工程技术水稻,以水稻胚乳作为“蛋白生产车间”来表达和生产重组蛋白质或者多肽的技术。整个生产过程包含了基因克隆、蛋白性高效表达,原料种植、收获、运输、储藏,蛋白提取、纯化、制剂等技术。

  利用水稻胚乳性启动子、水稻偏爱密码子优化、蛋白质定向存储技术,根据人血清白蛋白氨基酸序列,人工合成水稻偏爱密码子的人血清白蛋白基因全序列,将它克隆到水稻胚乳性的谷蛋白基因Gt13a的启动子和信号肽之后,构建了水稻载体pOsPMP114,然后成水稻植株,通过Western-blotting检测筛选出在水稻胚乳高效表达OsrHSA的基因工程纯合品系4-114-7。

  而后把培育的人血清白蛋白转基因水稻植株移植到稻田中,在工作人员的照顾下,转基因水稻几个月就结出稻谷。杨代常强调,OsrHSA经内膜系统进行加工和折叠成结构正确的有活性的蛋白质,并储藏在水稻种子的蛋白体内。

  经过多年技术改进,蛋白表达水平提高和纯化加工技术配套,最终杨代常团队得到的OsrHSA采取多种检测手段与人血清白蛋白进行结构确证,确认具有相同的一级、二级和高级结构。

  但杨代常研究启动后不久,反对声不断,甚至他自己也在辅料与药物两个方向之间摇摆。最后他跟自己打了个赌:按照当时99.9%的提纯技术,把OsrHSA杂质分离出来,按照临床10克的剂量计算,给予相当25倍临床剂量的杂质,用静脉注射的方式在大鼠身上试验,连续28天。观察下来,虽然有部分大鼠出现不适,但没有死亡。“起初我也很紧张,但试验最终证明是安全的。”杨代常回忆,这让他义无反顾地投入新药研发,直奔治疗用生物制品1类新药目标。

  “与酵母发酵技术相比,我们的技术更加绿色环保。同样生产1克重组HSA的能耗估算:1克重组HSA的水稻原料生产过程的能耗是酵母的1/28。”

  “重组人血清白蛋白的研究,学界攻关37年仍未有商业化产品出现,一是临床使用剂量高,二是市场价格相对低。”杨代常分析,使用剂量高意味着安全性风险高,因此对纯度要求高。纯度高意味着生产成本高,难以与目前市场价格较低的HSA竞争。“我们做过测算,每公斤稻米的血清白蛋白产量至少要达到3克才能真正进入市场。”

  在杨代常团队的研究中,确保安全控制成本始终是重中之重。用他自己的话说,“一步步来,踏实地解决高产量、优化工艺问题,提升质量,攻克检测技术。”

  “水稻种子的储藏蛋白不仅种类少,而且生化性质非常清楚。”杨代常兴致勃勃地告诉记者,尤其是水稻基因组数据详实,为设计分离纯化工艺提供了良好的技术支撑,让加工、提取和纯化工艺变得更简单。从水稻米粉中提取OsrHSA只需三步层析即阳离子、阴离子和疏水层析,就可达到医药级企业质量标准。如今,禾元生物可以实现1公斤稻米产出约10克血清白蛋白的世界最高产量水平,单批次生产周期能控制在36小时。

  更有利于成本控制的是,水稻胚乳细胞生物反应器将通过发酵合成蛋白质改为通过植物利用光合作用完成,“光是从商业化角度考虑,培养发酵不仅需要大量昂贵的发酵罐及其他配套设施,发酵过程中产生的废水也大大增加了生产成本。”他笑着说。

  当然,瞄准药用级别,即便纯化到99.99%,依然必须考虑杂质检测问题。“作为临床用途,产自细胞基质的产品所含寄主残留蛋白和DNA水平应当尽可能低。”他强调。科学家的本能让杨代常在研究过程中实时维系相应的专利,除了早年申报的“一种定量谷类生物残留DNA的标准操作方法”,2017年禾元生物也把“检测重组蛋白提取物中残留杂蛋白的性抗体及检测试剂”发明专利转移到公司。

  值得称道的是,除了公司发展,杨代常还带动了水稻种植。据统计,农民种植医用转基因水稻每亩增收980元,每年增加农民收入29.4万元,累计增加农民收入88.2万元。光是2013-2015年就获得100吨左右的人血清白蛋白稻谷原料,可生产人血清白蛋白390~450公斤,含有人血清白蛋白的稻谷产值1006万元。

  “在我的计划里,OsrHSA只是第一步。我们团队构建的核心是以水稻种子生物反应器技术平台为基础,利用胚乳性调控元件、蛋白定向储存和密码子优化等综合技术,建立高效表达重组蛋白的农业生物制药技术体系。”

  2015年,禾元生物在全国中小企业股份转让系统(新三板)挂牌。然而,由于多个新药项目正处于研发的投入阶段,禾元生物出现持续亏损。为了提升盈利能力,杨代常调整企业步调,提高技术服务项目,扩大快消品销售渠道,以保障新的利润增长点。禾元生物的盈利能力逐步改善,完成了多次股票发行募资。

  然而,今年年中,禾元生物还是终止在新三板挂牌。回顾这段历程,杨代常坦言,当初挂牌,一是考虑融资,二是期望借助转板通道,让早期投资者有退出通道。

  如今,杨代常不仅考虑国内市场。禾元生物的OsrHSA数年前已成功获得美国FDA的DMF文件号。“亚洲、非洲都有相当大的开发潜力。”他透露,目前企业正在进行FDA的IND申报。

  “人才,特别是研发人才,需要企业自己培养。”杨代常语气中带着些许无奈,这一研究方向的特殊性,决定了从其他企业挖人的可能性很低。与其他生物医药企业不同,禾元生物的研发团队需要具有细胞生物学、药理学、生物化学、临床医学等多种专业背景的复合型人才,不仅需要扎实的理论基础,更要有蛋白质和多肽表达及纯化工艺研究等生物医药项目研发的丰富经验。

  十多年过去,杨代常不仅带出了一批专业的研究团队,也引领禾元生物建立起利用植物表达体系进行生物制药的完整产业化体系。他们利用自家的水稻胚乳细胞蛋白质表达平台和蛋白质纯化平台,开发出包括重组人血清白蛋白(OsrHSA)、重组人抗胰蛋白酶(OsrAAT)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(OsrbFGF)、重组人酸性成纤维细胞生长因子(OsraFGF)、重组人乳铁蛋白(OsrLF)、重组人胰岛素样生长因子 1(OsrIGF-1) 和重组人溶菌酶等系列产品。

  杨代常预测,未来3年禾元生物有望推出3~4个“水稻系”新药。也许在不久的将来,以水稻种子作为生物反应器的技术平台将孵化出更多产品,成为我国生物制药又一新途径,一度被视为天方夜谭的梦想终将实现。